TECNOLOGIE MOLECOLARI E RICOMBINANTI
Anno accademico e docente
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- English course description
- Anno accademico
- 2022/2023
- Docente
- ALESSIA FINOTTI
- Crediti formativi
- 6
- Periodo didattico
- Secondo Semestre
- SSD
- BIO/11
Obiettivi formativi
- Il Corso ha l'obiettivo di consentire allo studente l'acquisizione delle conoscenze delle tecniche e metodologie di base e dei loro ulteriori sviluppi applicativi per lo studio ed analisi degli acidi nucleici e dell’espressione genica, con particolare riferimento alle tecnologie impiegate per la produzione di DNA ricombinante
L’esercitazione pratica darà la possibilità allo studente di concretizzare le conoscenze teoriche acquisite e sarà incentrata su alcune tra le metodiche più utilizzate nei comuni laboratori di ricerca e contestualmente apprendere l’utilizzo di strumentazioni di base. In particolare, gli studenti impareranno ad usare le pipette e altre comuni strumentazioni di laboratorio, ed affronteranno i diversi passaggi sperimentali volti all'analisi dell'espressione genica, attraverso le tecniche di estrazione dell'RNA, la sua quantificazione tramite spettrofotometro; l'analisi qualitativa mediante elettroforesi su gel d'agarosio e confronto con altri tipi di acidi nucleici; la produzione di cDNA mediante retro-trascrizione e la quantificazione di specifici RNA messaggeri mediante reazione di amplificazione (RT-PCR).
CONOSCENZA E COMPRENSIONE
Lo studente apprenderà:
- la corretta terminologia scientifica
- le tecniche di base per l'estrazione, la quantificazione e l’analisi di acidi nucleici
- le tecniche di base per l’analisi genomica e trascrittomica
- gli elementi di base per costruire un vettore ricombinante
- le differenze tra i diversi tipi di vettori ricombinanti
CAPACITA’ DI APPLICARE CONOSCENZA E COMPRENSIONE
Lo studente saprà:
- quale metodo utilizzare per estrarre il DNA, l'RNA da diverse fonti biologiche
- quali tecniche sono impiegate nelle analisi genomica e trascrittomica
- quali strategie utilizzare per effettuare un esperimento di clonaggio genico
- quali vettori usare per produrre una proteina ricombinante
- quali vettori usare per modificare l'espressione genica Prerequisiti
- Conoscenze di base di Chimica, Biologia, Biochimica e Biologia Molecolare.
Contenuti del corso
- Il corso Tecnologie Molecolari e Ricombinanti consiste in 40 ore (5CFU) di didattica frontale
Tematiche affrontate:
PRIMA PARTE: Analisi degli acidi nucleici e loro espressione e/o modulazione:
-Isolamento e purificazione di DNA, quantificazione ed analisi: elettroforesi in gel d’agarosio e poliacrilamide, elettroforesi capillare;
-Tecniche per studio del genoma: impiego di enzimi per la manipolazione del DNA (enzimi di restrizione, polimerasi, ligasi, etc.), Southern Blotting, reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR) e sue varianti, qPCR, sequenziamento genico classico e Next Generation Sequencing;
-Isolamento, purificazione, quantificazione di RNA e microRNA;
-Tecniche di base per studio dell’espressione genica: retro-trascrizione e produzione di cDNA, Real Time PCR quantitativa, digital PCR, cenni sulle tecniche per analisi trascrittomiche: gene expression array ed RNA sequencing (lezioni tenute dalla Dott.ssa Lucia Carmela Cosenza);
SECONDA PARTE: Tecniche di manipolazione del DNA, vettori di clonaggio, vettori di espressione, metodologie di trasfezione, proteine ricombinanti:
-Impiego di enzimi per clonare il DNA;
-Tipi di vettori di clonaggio e loro applicazioni (plasmidi, batteriofagi, cosmidi, ecc);
-Tecniche per l’introduzione di vettori ricombinanti nelle cellule;
-Introduzione ai vettori virali per terapia genica;
-Metodi per la produzione di proteine ricombinanti: vettori e sistemi di espressione delle proteine ricombinanti, pharming, produzione di animali transgenici.
TERZA PARTE: Tecniche per studio dell’espressione e della funzione dei geni.
-Tecniche per individuazione di sequenze geniche, di promotori genici e del loro legame con fattori di trascrizione; Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP),
-Saggi mediante geni reporter;
-Analisi della metilazione del DNA;
-Mutagenesi in-vitro;
-Impiego di RNA interference e altri approcci per il gene silencing;
-Tecniche di studio dei microRNA.
Oltre alle 40 ore di lezione frontale (5CFU), sarà tenuta una esercitazione di laboratorio (1CFU) suddivisa in una parte pratica in laboratorio affiancata da una parte precedente di preparazione al laboratorio e una successiva di analisi dei risultati ottenuti, effettuate tramite lezioni in PowerPoint, filmati, animazioni, analisi dei dati ed esercizi. Argomento principale: estrazione di RNA totale da matrici biologiche, la sua quantificazione spettrofotometrica, analisi quali-quantitativa dell’RNA estratto mediante elettroforesi su gel di agarosio e confronto con altri tipi di acidi nucleici, retrotrascrizione e PCR (RT-PCR multiplex) di trascritti selezionati, interpretazione dei risultati ottenuti. Metodi didattici
- Il corso è organizzato in 40 ore di didattica frontale. Gli argomenti del corso saranno affrontati in modo approfondito nelle lezioni in aula, dove peraltro saranno presentati anche riferimenti su riviste scientifiche, siti web trattanti i vari argomenti e video esplicativi. Gli argomenti trattati saranno spiegati attraverso presentazione PowerPoint, che verranno di volta in volta fornite, in formato PDF, dal docente agli studenti. Nei testi consigliati non sono trattati tutti gli argomenti del corso e risulta pertanto vivamente consigliata la partecipazione alle lezioni. All’occorrenza saranno organizzati dei focus group utili per chiarimenti su argomenti già affrontati nel corso e per un ripasso delle nozioni chiave.
Oltre alle 40 ore di lezione frontale (5CFU), sarà tenuta una esercitazione di laboratorio (1CFU) suddivisa in una parte pratica in laboratorio affiancata da una parte precedente di preparazione al laboratorio e una successiva di analisi dei risultati ottenuti effettuate tramite lezioni in PowerPoint con il possibile ausilio di filmati, animazioni, analisi dei dati ed esercizi.
Per l’esercitazione pratica gli studenti verranno divisi in turni, e lavoreranno singolarmente o a gruppi. Modalità di verifica dell'apprendimento
- La prova d’esame ha lo scopo di verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti trattati nel corso e la capacità di ragionamento sviluppata dallo studente.
L’esame consiste in una prova scritta che comprende 17 domande a risposta multipla con risposte chiuse (5 possibilità di risposta di cui una sola corretta) e sarà svolto utilizzando Google Moduli. La durata dell’esame sarà 25 minuti.
Per gli studenti DSA verrà valutata singolarmente la modalità di svolgimento della prova.
Ogni domanda con risposta corretta vale 2 punti. Per superare l’esame (voto minimo 18/30) sarà necessario rispondere correttamente ad almeno 9 quesiti. La votazione di 30 si raggiunge con 15 risposte corrette. Il voto di 30 e lode si conseguirà rispondendo correttamente a 16 oppure a 17 quesiti. Non verranno dati punti di penalizzazione per risposte sbagliate o risposte non date. Testi di riferimento
- Diapositive mostrate a lezione dal docente e fornite in formato PDF, materiale fornito dal docente (es: articoli e review scientifiche, siti web, video). Tutto il materiale verrà caricato sulla Classroom del corso.
¿ Testo principale consigliato:
-Biotecnologie Molecolari. Principi e tecniche. Terry A. Brown - ZANICHELLI
Eventuali approfondimenti sui seguenti testi:
-Metodologie biochimiche e biomolecolari. M. Maccarrone - ZANICHELLI
-Genomi 4. IV edizione, 2018. Terry A. Brown - EDISES
-DNA ricombinante. Geni e Genomi. J.D. Watson et al. - ZANICHELLI
-Analisi dei Geni e Genomi. Richerd J. Reece - EdiSES
-Compendio di Biotecnologie Farmaceutiche. Maria Luisa Calabrò - EdiSES
-Metodologie Biochimiche. Bonaccorsi di Patti, Contestabile, Di Salvo - ZANICHELLI
