Test di citotossicità su cheratinociti

• Cheratinociti umani/Linee cellulari:

-       HeLa, Ca-Ski e SiHa, cellule epiteliali umane immortalizzate, isolate da tumore della cervice uterina.

-       HaCaT e NCTC, cheratinociti umani spontaneamente immortalizzati, isolati da epidermide.

-       NCTC-eGFP, cheratinociti umani resi fluorescenti stabilmente mediante la trasfezione con un plasmide contenete il gene che codifica per la green fluorescent protein         (GFP). PMID:17390321

Test di vitalità cellulare:

Saggio basato su particolari cheratinociti fluorescenti nei quali è stato dimostrato che l'intensità di fluorescenza è proporzionale alla quantità di cellule presenti nel campione. Su questa base misurando il valore di fluorescenza del campione è possibile risalire al numero di cellule presenti e quindi alla vitalità cellulare del campione stesso. PMID: 17390321

Test di alterazione morfologica:

Saggio basato sulla colorazione del citoscheletro e altre strutture cellulari con anticorpi monoclonali fluorescenti osservate e fotografate al microscopio U.V. PMID:25388843

Test di proliferazione cellulare mediante il test Alamar Blue:

Saggio metabolico che permette di quantificare la proliferazione cellulare grazie all’incorporazione di un indicatore di ossido-riduzione che cambia colore in risposta alla riduzione chimica del terreno di coltura derivante dalla crescita cellulare. PMID:28659417

Valutazione quantitativa dell’espressione genica mediante Real-time-PCR quantitativa (qRT-PCR):

Saggio per dimostrare una eventuale variazione dell’espressione genica in seguito all’esposizione dei cheratinociti al prodotto da testare. L’analisi di espressione genica verrà eseguita in maniera personalizzata in base alle esigenze del cliente. PMID:25205602

Valutazione qualitativa e quantitativa dell’espressione genica mediante Digital Droplet PCR (ddPCR):

Approccio molecolare di ultima generazione capace di misure precise e accurate, le cui performance in termini di applicabilità e sensibilità, evidenziano una maggiore efficienza di quantificazione dell’acido nucleico target (DNA, mRNA, miRNA) confrontato con altre tecniche di PCR. Il sistema ddPCR è basato sulla ripartizione del campione in migliaia di goccioline in un’emulsione olio-acqua, la successiva amplificazione dell’emulsione contenente l’acido nucleico target, infine l’analisi delle goccioline contenti l’acido nucleico target (positive) e non (negative) mediante la statistica di Poisson. Non necessita della presenza di una curva di calibrazione e materiali di riferimento, riducendo i tempi e i costi di analisi. PMID:30740692

Valutazione dell’attività antiossidante:

Saggio per valutare se il prodotto testato possiede attività anti-ossidante in vitro su colture cellulari. Per questo motivo viene testata la sua capacità di ridurre la formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Tale capacità dovrebbe essere utile per contrastare l’invecchiamento cutaneo.

Valutazione delle citochine/chemochine/fattori di crescita cellulari:

Analisi di fattori secreti nel terreno di coltura dalle cellule coltivate a contatto con il prodotto da saggiare. Questo saggio viene eseguito con kit commerciali mediante test immunologici ELISA. PMID:25162674; PMID:32998835

Valutazione delle proteine cellulari:

Proteine espresse dalle cellule coltivate a contatto con il prodotto da saggiare. Questo test viene eseguito, con kit e anticorpi monoclonali commerciali, mediante western blotting. PMID: 9304878

Analisi epigenetiche:

1. Saggio di metilazione dei promotori dei geni bersaglio sul DNA estratto da cellule coltivate a contatto con il prodotto da saggiare. PMID:29898214
2. Saggio di espressione dei microRNA espressi all’interno delle cellule oppure secreti nel terreno di coltura dalle cellule coltivate a contatto con il prodotto da saggiare.

PMID:21358347; PMID:27716620

Saggio di senescenza cellulare con cheratinociti umani:

Il saggio della β-galattosidasi è un saggio colorimetrico ampiamente utilizzato per individuare le cellule senescenti all’interno di una popolazione cellulare. Tale saggio si basa sull’espressione dell’enzima β-galattosidasi, un enzima idrolitico che catalizza l’idrolisi dei residui terminali di β-D-galattosio nei polisaccaridi tramite la rottura dei legami beta-glicosidici. Tale enzima risulta sovraespresso a pH 6.0 nelle cellule in fase di senescenza ed è definito come SA-β-gal (senescence-associated β-galattosidasi). Il rilevamento della SA-β-gal si basa sull’utilizzo del substrato cromogenico detto X-gal. L’idrolisi dell’X-gal ad opera della β-galattosidasi produce un composto blu insolubile facilmente osservabile al microscopio ottico. Il saggio viene eseguito su cheratinociti umani normali.

In collaborazione con la Professoressa Margherita Maioli

Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari, Viale San Pietro 43/B, 07100 Sassari, Italia; Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Monserrato, Cagliari, Italia

Prof. Mauro Tognon
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